2023年6月22日，《Small Methods》在线发表了本实验室张玉慧教授课题组与合作团队，包括：武汉血液中心马严课题组、华中科技大学同济医院妇产科韩志强教授课题组、华中科技大学同济医院血液科洪振亚副教授课题组、华中科技大学同济医院神经外科张华楸教授课题组及广州超视计公司，共同完成的题为 Superresolution fluorescence microscopy of platelet subcellular structures as a potential tumor liquid biopsy 的研究论文。
该研究在国际上率先提出一种全新基于血小板亚细胞结构超分辨荧光成像的肿瘤液体活检方法（图1），把超分辨荧光显微成像技术、血小板荧光标记技术、智能图像识别与处理技术与肿瘤临床检测相结合，充分发挥多学科交叉融合优势，实现了对血小板亚细胞结构的超分辨检测及统计分析，为肿瘤液体活检提供了一种全新亚细胞水平而不是现有细胞或分子水平的血小板量化检测指标，有望为肿瘤患者诊疗提供新的突破点，为超分辨成像技术临床应用开辟新的途径。
图1 检测流程示意图
癌症严重危害人类生命健康，已成为当前最严重的公共健康问题之一。因肿瘤的异质性及作用机制的复杂性，开发便捷方法获取更多疾病信息对肿瘤的诊疗具有重要意义。基于血液的肿瘤液体活检由于其无创性、便利性和安全性，有望成为组织活检的替代或补充。其中，血小板在肿瘤进展的所有阶段都起着重要作用，其丰沛性、易获得性使其在肿瘤液体活检上具有巨大潜力，但现有临床检测所能提供的血小板检测指标（如：血常规及血小板功能检测）非常有限，远不能满足现有临床诊疗的需求。血小板亚细胞结构（如：微管、α-颗粒、致密颗粒等）是反映其生理状态的敏感指标，现有研究虽表明其变化与肿瘤的发生发展密切相关，但还停留在发现已知疾病中的现象来研究具体分子机制的阶段，与肿瘤的辅助诊疗需求还相差甚远。同时，因血小板亚细胞结构尺寸很小，受限于光学衍射极限，利用传统光学显微镜很难对其进行精确检测，目前主要使用电镜进行检测，而电镜的样本处理复杂，成像区域很小，很难进行快速大规模成像，因此很难应用于临床。
近年来发展的超分辨荧光显微镜（Superresolution Fluorescence Microscopy，SRM）能清晰地可视化细胞中的亚细胞结构，并已广泛应用于生命科学领域，但其在基于血液的疾病诊断中的应用仍处于起步阶段。目前还没有利用SRM技术检测血小板亚细胞结构用于癌症诊断的报道，通过SRM获得的血小板亚细胞结构特征能否成为潜在的肿瘤生物标志物还是未知的。
针对上述需求和难点，张玉慧教授课题组及合作团队提出了利用SRM技术检测血小板亚细胞结构分布模式的新型肿瘤液体活检方法。由于血小板具有对环境变化敏感和易激活的特性，因此在利用血小板亚细胞结构进行临床检测时，如何尽量减少血小板储存、分离和固定过程中体外因素对亚细胞结构的干扰，对于检测结果的准确性和可靠性具有重要意义。因此，文中首先建立了血小板样品制备的标准化流程，筛选出最优血小板亚细胞结构荧光标记方法，为高通量获得血小板亚细胞结构超分辨荧光图像奠定基础。通过大量数据分析，发现了肿瘤患者血小板中微管和α-颗粒的全新分布模式。在微管中，健康对照组主要是圆环线圈模式，而在肿瘤患者中发现了多种先前未曾报道的微管分布模式，如：弥散模式、不规则模式和聚集模式（图2）。在α-颗粒中，健康对照组主要是n<30（n为α-颗粒的数量）分布模式，而在肿瘤患者中发现了多种先前未曾报道的α-颗粒分布模式，如n≥30分布模式、环状模式和聚集模式（图2）。
图2 基于结构光照明超分辨荧光显微镜（SIM）图像的血小板亚细胞结构分类
利用结构光照明超分辨荧光显微镜可以获取大量的血小板亚细胞结构超分辨图像，但缺少针对血小板亚细胞结构图像高通量自动化分析方法。针对上述问题，文中还开发了一套定制化智能图像处理和分析软件，实现了对血小板超分辨图像数据准确、快速及自动的分割、识别、分类及统计分析。最后，利用上述技术对肿瘤患者（包括：骨髓增殖性肿瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌及脑胶质瘤）与健康对照组、良性肿块患者的血小板亚细胞结构进行对比统计分析。结果表明，α-颗粒在血小板中的分布模式有潜力成为多种癌症的生物标志物，包括：胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌，其不仅有助于这些疾病的诊断，还具有评估治疗效果的潜力。
图3 肿瘤患者与健康对照组、良性肿块患者的血小板亚细胞结构的比较
华中科技大学武汉光电国家研究中心博士后徐彭、博士生邓欢和华中科技大学同济医院血液科洪振亚副教授为共同第一作者。华中科技大学武汉光电国家研究中心张玉慧教授、华中科技大学同济医院妇产科韩志强教授和武汉血液中心马严博士为共同通讯作者。共同作者包括华中科技大学武汉光电国家研究中心钟思梅、陈非凡、华中科技大学同济医院妇产科王良良、华中科技大学同济医院血液科王镇灏、梅宇、华中科技大学同济医院神经外科张华楸教授、淦超及广州超视计公司罗梓颖、何子亮、李海文。
该项目得到国家重点研发计划(2022YFC3401100)、国家自然科学基金(92054110、32271428、61827825、81873430、81974414、31600692)、湖北省重点研发计划(2022BCA027)、国家自然科学基金创新研究群体科学基金（61721092）、湖北省卫生计生科研基金(WJ2023M138)和武汉光电国家研究中心主任基金的支持。
