（文章来源：CellPress细胞科学，作者：Cell Press）2023年2月8日，本实验室朱䒟教授课题组在Cell Press细胞出版社旗下刊物Cell Reports Methods上发表题为“A versatile vessel casting method for fine mapping of vascular networks using a hydrogel-based lipophilic dye solution”的研究论文。文中提出了一种基于脂溶性染料水凝胶的整体血管网标记方法VALID，可以高效地实现对小鼠完整器官血管网的均匀、完整标记，这为各种组织器官血管网络的三维整体观察、特别是血管相关疾病所致的血管重塑的评估提供了可靠的研究手段。
本实验室博士后朱京谭，博士生刘晓梅和博士后徐健壹为共同第一作者，通讯作者为朱䒟教授和俞婷婷副研究员。
高效、完整地标记组织器官血管网络是实施血管结构三维整体成像的第一步，也是最重要的一步。传统的荧光血管标记方法往往存在这样那样的不足，诸如血管标记亮度低、标记不完整、染料渗漏或者成本过高等。为有效解决此类问题，获得高质量的血管网图像，朱䒟教授课题组另辟蹊径，发展了一种新型的血管标记方法，命名为“VALID”。
VALID方法采用荧光亮度强、性价比高的脂溶性染料作为血管的荧光标记物，并通过添加一定比例的明胶，成功抑制脂溶性染料在水溶液中的析出，形成稳定的染料水凝胶。通过心脏灌注这种水凝胶，即可实现对血管网的完整、均匀标记，结合光透明成像即可获得信噪比高的整体血管网络结构信息。从图1可以看出，未使用VALID方法标记的血管不均匀，且有因染料渗漏形成的漏点，而经过VALID方法标记的血管则完整且连续，无漏点。
图1. VALID实现完整、均匀、高信噪比的血管网结构标记
相比于传统血管标记方法，如CD31抗体、凝集素等，VALID表现出了更高的标记效率，且在特定器官上对大血管的标记能力要明显强于传统血管标记方法，如图2所示。此外，VALID也可以有效兼容常规的荧光免疫标记技术，这使得VALID不仅可以有效地标记血管，而且还可以结合免疫标记技术同时获取血管网和不同细胞类型结构信息。
图2. VALID血管标记能力与传统血管标记方法比较
脂溶性染料与主流光透明方法的难以兼容一直是一个悬而未决的难题。在本研究中，我们发现VALID中明胶的引入显著增强了脂溶性染料与传统有机溶剂透明方法的兼容性，使得脂溶性染料标记的血管结构信息可以有效抵抗有机溶剂方法的洗脱，这在光透明领域是一重大突破。
利用VALID，我们成功地将脂溶性染料与有机溶剂透明方法结合起来，对小鼠大脑和脊髓内的血管系统进行了3D重建，如图3所示。VALID将为高效血管标记提供一种简单、经济的方案，也将大大拓宽脂溶性染料在脑血管并发症研究领域的应用。
图3. VALID结合传统有机溶剂方法获取三维血管网结构信息
该项目得到科技部重点研发计划、国家自然科学基金委重点国合、中国博士后创新人才计划、光谷实验室创新专项及武汉光电国家研究中心创新专项的支持。
Cell Press细胞出版社公众号特别邀请朱䒟教授代表研究团队接受了专访，请她为大家进一步详细解读。
CellPress：
请问目前常用的血管网标记方法有哪些？存在哪些需要改进的地方？
现有的血管标记方法根据原理可以分为三类：转基因标记、血管特异性分子物标记以及填充式标记。转基因标记是通过转基因技术让实验动物（如小鼠）血管内皮表达内源性荧光蛋白，从而达到标记血管的目的。但这种方式耗时耗力，且存在未知的非特异性表达。血管特异性分子物标记是通过活体静脉注射一些血管特异性分子标记血管网络，如番茄凝集素、CD31抗体等。但通过这种方式标记的血管网结构往往不够完整，且荧光亮度较低。通过心脏灌注染料的方式标记血管具有完整度高、信号亮的优势，但往往存在染料渗漏、血管结构破坏的问题。
CellPress：
请问VALID的工作原理是怎样的，与传统标记方法有何不同？
朱䒟教授：
VALID属于通过心脏灌注染料的方式来标记整体血管网。但是在染料选择和溶液配制时做了一些巧妙设计。我们选用生物研究中常用的脂溶性染料，这种染料具有成本低、荧光亮度高、可与细胞膜结合等优势，是一种非常理想的血管填充染料。但是，直接通过脂溶性染料水溶液灌注进行血管标记也存在类似的通病，如染料渗漏。这是由于大多数亲脂性染料是高度疏水的，导致染料分子在灌注过程中快速聚集，堵塞血管导致其破裂。我们通过向脂溶性染料水溶液加一定比例的明胶，使其变成非常稳定的水凝胶，染料分子在水凝胶中可以稳定的保持几天都不会析出。得益于此，VALID可以高效、完整且均匀地标记多种器官血管网结构。
CellPress：
请问VALID是如何做到与基于有机溶剂的光透明方法兼容的？
朱䒟教授：
脂溶性染料和目前主流光透明方法不兼容一直是该领域一个悬而未决的难题。主流光透明方法大都采用一些可以去脂的有机溶剂，使得脂溶性染料在透明过程中就被清除干净。在本研究中我们发现，用VALID标记的脂溶性染料荧光信号成功地抑制了透明过程中有机溶剂的洗脱，并在透明后保留得较好。而这很大程度上得益于VALID对脂溶性染料信号的双重稳固效应：一方面脂溶性染料在血管内形成稳定的水凝胶，有效地阻止有机溶剂的洗脱；另一方面部分脂溶性染料分子也会插入血管内皮细胞的质膜，起到一定的固定作用。我们推测这同时存在的两种效应共同赋予了脂溶性染料分子抵抗有机溶剂洗脱的能力。
CellPress：
VALID能够将血管网络可视化到毛细血管水平，这将对治疗血管相关疾病起到怎样的帮助？
朱䒟教授：
现代光学成像技术的出现，如共聚焦、多光子和光片显微成像技术，为获取毛细血管水平的血管网结构信息提供了强大的工具。近年来，通过血管标记、组织透明和光学成像技术三者有机结合，可以实现血管网三维成像。而VALID则提供了一种简单、高效的血管标记方法，具有强大的血管标记能力和光透明兼容性。此外，VALID也可以与免疫标记同时用于血管和不同细胞类型的研究。因此，VALID可以为各种类型组织血管网络的三维可视化以及特定血管相关疾病发生后血管重塑的评估创造了可靠的研究手段，有望为病理疾病模型中血管病变的评估提供强有力的工具。
https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00018-8
